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    免疫沉淀實驗操作指南

    該免疫沉淀實驗方法僅供參考,由于每個實驗使用的試劑不同,并且涉及不同的物種,組織類型及實驗應用,實驗人員設計應根據具體情況設計實驗步驟和改良。

    所需試劑

    細胞準備:

    • Tris 緩沖鹽溶液(TBS). 使用 10x TBS, pH 7.5 (1.0M Tris HCl, 1.5M NaCl). 用適量去離子水稀釋到 可在室溫下保存一個月 .

    • 裂解緩沖液. 含有0% 合適洗滌劑的TBS、1mg/ml的 牛血清白蛋白 BSA、合適的蛋白質酶抑制劑.

    • 稀釋緩沖液. 與裂解緩沖液相同, 除去蛋白質酶抑制劑.

    • 用于裂解物預處理的瓊脂糖軛合物. 預吸收裂解物以移除與一抗二抗的非特異結合. 用來自同一物種的瓊脂糖標準 IgG做一抗, 抗宿主的二抗. 用稀釋緩沖液1:1制備懸浮液.

    一抗:

    • 一抗的對照. 對于多抗血清, 使用來自同一物種的未免疫的血清. 單克隆抗體使用相同亞型和純度.

    • 免疫沉淀的瓊脂糖軛合物. 使用抗一抗宿主的瓊脂糖二抗. 用稀釋緩沖液1:1制備懸浮液.

    • Tris 緩沖液. 制備05M 的Tris 緩沖液, pH 6.8.

    • 2x SDS-PAGE 樣品緩沖液

    • 2-巰基乙醇

    實驗步驟
    1. 將5 x 107 細胞置于裂解緩沖液中, 在冰上孵育30-60 分鐘制備裂解液.

    2. 渦旋裂解液后置于離心機上250 x g離心10分鐘, 除去細胞核留下上清液.

    3. 將上清液于100,000 x g離心30分鐘, 或者微型離心機10,000 x g 離心30分鐘, 再取上清液.

    4. 加入瓊脂糖軛合物來預處理裂解液以除去非特異的蛋白結合. 每200 μl 裂解液使用10μl 對照瓊脂糖. 于4oC下震蕩1小時. 200 x g離心. 留上清液.

    5. 向兩個微離心管中各加入 200 μl 含有抗原的預處理了的裂解液. 用稀釋緩沖液將體積補至 1 ml.

    6. 向一個離心管中加入一抗. 對于多克隆抗血清或腹水加入5-5 μl一抗. 對組織培養上清液加入 10-100 μl一抗. 向第二個離心管加入同等體積的一抗對照. 冰上孵育1小時.

    7. 做免疫沉淀時每個管加入50μl瓊脂糖軛合物. 4oC下輕微震蕩1小時.

    8. 于200 x g離心1分鐘或微型離心機離心5秒鐘. 用移液管小心移出上清液. 用1 ml 稀釋緩沖液輕緩重新懸浮底部團塊. 重復洗滌. 先用TBS洗滌最后用5 M Tris, pH 6.8洗滌.

    9. 如上所示再次離心. 加入20-50 μl 樣品緩沖液. 混合后在100 oC加熱5分鐘. 稍微微離心一下, 將上清液直接用于非還原性電泳SDS-PAGE. 如果需用還原性條件, 將上清液轉移到新管中加入5% 2-巰基乙醇. 如上混合加熱.

    10. 電泳蛋白質混合物. 染色凝膠或免疫印跡 (使用我們 Western Blot 的實驗方案) 顯色. 顯現的條帶包括抗原的多肽鏈和使用的抗體.

    怎樣選擇正確的珠子:

    物種免疫球蛋白亞型Protein AProtein G
    人 IgG1結合力強結合力強
    人 IgG2結合力強結合力強
    人 IgG3沒有結合力結合力強
    人 IgG4結合力強結合力強
    人 IgM使用抗 人 IgM
    人 IgE沒有結合力結合力弱
    人 IgA沒有結合力結合力弱
    小鼠 IgG1結合力弱結合力強
    小鼠 IgG2a結合力強結合力強
    小鼠 IgG2b結合力中等結合力中等
    小鼠 IgG3結合力弱結合力弱
    小鼠 IgM使用抗小鼠 IgM
    大鼠 IgG沒有結合力結合力弱
    大鼠 IgG2a沒有結合力結合力強
    大鼠 IgG2b沒有結合力結合力中等
    大鼠 IgG2c結合力弱結合力中等
    雞的 所有亞型沒有結合力沒有結合力
    牛的所有亞型結合力中等結合力強
    山羊的所有亞型沒有結合力結合力中等
    豚鼠所有亞型結合力強結合力中等
    倉鼠所有亞型結合力弱結合力中等
    馬的所有亞型結合力弱結合力強
    豬的所有亞型結合力弱結合力中等
    兔的所有亞型結合力強結合力中等
    綿羊的所有亞型沒有結合力結合力強


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