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    免疫熒光實驗操作指南

    該免疫熒光實驗方法僅供參考,由于每個實驗使用的試劑不同,并且涉及不同的物種,組織類型及實驗應用,實驗人員設計應根據具體情況設計實驗步驟和改良。

    切片制備

    A. 細胞涂片

    • 將培養的細胞生長于無菌的蓋玻片或載破片上,37o C過夜孵育。

    • 用PBS簡單洗滌。

    • 按需固定. 可用的步驟有:

      • 含10% 福爾馬林的PBS 固定10分鐘 (保持濕潤).

      • 冰冷的甲醇固定5分鐘,自然干燥。

      • 冰冷的丙酮固定5分鐘,自然干燥。

    • 用PBS沖洗。

    B. 冷凍組織切片

    • 在液氮或用液氮預冷的異戊烷中切割冷凍的新鮮組織, 放置于含有OCT凍存液的cryomolds被膜中. 速凍后保存在 – 80 oC。

    • 用恒冷箱切片機將組織切成4-8 um 厚的切片,然后固定在急凍切片或明膠包被過的切片。使用前將切片保存于 – 80 oC。

    • 染色之前,將切片置于室溫下 30分鐘然后于冰冷的丙酮中固定5分鐘。自然干燥30分鐘。

    • 在PBS中漂洗。

    C. 石蠟組織切片

    • 將切片在二甲苯中去石蠟兩次,每次5min.

    • 使用100% 乙醇水化兩次,每次3min.

    • 使用95%乙醇水化 1min.

    • 蒸餾水漂洗.

    • 按需根據預制備步驟操作.

    組織切片預制備

    *對于非石蠟包埋的冷凍切片和培養細胞,請不要使用該預制備步驟。

    被福爾馬林固定和石蠟包埋封閉的抗原決定簇可以使用抗原修復劑、酶消化或肥皂精等來使之顯示。

    步驟
    1. 在PBS-Tween 20 中漂洗切片兩次,每次2分鐘。

    2. 血清封閉: 用正常血清封閉孵育切片 – 物種來源應與二抗相同, 孵育30分鐘來封閉非特異的免疫球蛋白結合。 注意:由于該實驗使用的 avidin-biotin 檢測系統, 根據組織類型不同,可能需要avidin/biotin 封閉,avidin/biotin 封閉應在正常血清封閉之后。

    3. 一抗: 在一抗溶液中孵育切片,室溫下1小時或4 °C過夜。

    4. 在PBS-Tween 20中漂洗。

    5. 二抗: 在生物素化二抗溶液中孵育切片,室溫下30分鐘。

    6. 用PBS-Tween 20 漂洗三次,每次2分鐘。

    7. 檢測: 在含FITC-Avidin D 的PBS溶液中孵育切片,室溫下30分鐘。從該步驟開始要確保切片避光,直到最后將切片用鋁箔紙包裹或放進避光盒子中。

    8. 用PBS-Tween 20 漂洗三次,每次2分鐘。

    9. 如需要,用PI 或 DAPI 復染色。

    10. 在PBS-Tween 20中漂洗。

    11. 用95% 乙醇脫水 2 分鐘, 100% 乙醇脫水兩次,每次3分鐘。

    12. 用抗褪色固定介質覆蓋切片。


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