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    免疫細胞化學實驗操作指南

    該免疫細胞化學實驗方法僅供參考,由于每個實驗使用的試劑不同,并且涉及不同的物種,組織類型及實驗應用,實驗人員設計應根據具體情況設計實驗步驟和改良。

    所需試劑
    • PBS 洗滌液. 磷酸鹽緩沖液 (PBS). 使用 10x PBS, pH 7.2 (0.2M 磷酸鉀, 1.5M NaCl). 用適量去離子水稀釋到1x.

    • 甲醛固定. 用PBS稀釋到 4%.

    • 抗體稀釋液. 制備100ml 的PBS 洗滌液,加入1ml 與二抗宿主同物種的正常血清.

    • 生物素化的二抗. 在抗體稀釋液中制備生物素化的二抗溶液. 使用抗一抗宿主的生物素化的二抗.

    • 鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶. 在PBS緩沖液中制備鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液.

    • DAB 底物.

    • 蘇木精復染色以及固定介質.

     

    步驟
    1. 將細胞生長于顯微鏡載玻片,或蓋玻片,或細胞培養板上。除去培養基液,用冰冷的PBS小心清洗細胞3次。用含4%甲醛的PBS溶液于冰上固定細胞30分鐘,使用的甲醛溶液應與最初培養基液體積相等。棄去固定液,用PBS沖洗3次每次5分鐘。如需要,可在含1% H2O2 的PBS溶液中孵育5分鐘,以除去內源的過氧化物酶活性。用PBS清洗固定的細胞3次,每次5分鐘。

    2. 用抗體稀釋液制備適宜濃度的一抗溶液。移去細胞上的緩沖液。加入足夠量的一抗使其覆蓋細胞。室溫下孵育一抗60分鐘。如果一抗與抗原的親和力較低,可于4oC下過夜孵育。移去一抗溶液。用PBS清洗3次,每次5分鐘。

    3. 移去細胞上的緩沖液。加入稀釋的生物素化的二抗,室溫下孵育30分鐘。最佳的稀釋度每個批次二抗有所不同。用PBS清洗3次,每次5分鐘。

    4. 移去細胞上的緩沖液。加入稀釋的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶,室溫下孵育30分鐘。移去溶液。 用PBS清洗3次,每次5分鐘。

    5. 移去緩沖液。加入DAB底物,孵育大概10分鐘或者直到反應顏色足夠深。

    6. 移去溶液。用蒸餾水清洗3次,每次2分鐘。用蘇木精復染色,根據濃度和所需顏色深度的不同,染色1至5分鐘。用蒸餾水清洗3次,每次2分鐘。用100%的乙醇給細胞脫水4次,每次2分鐘。用二甲苯清洗細胞4次每次2分鐘。加入2~3滴固定介質,固定好蓋玻片使之風干。

    7. 在顯微鏡下觀察細胞。陽性反應應是可見的棕色沉淀。細胞核應顯淺藍色。


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